Leica EM GP2 - Автоматическая плунжерная система криофиксации образцов по технологии «голая сетка»
Применение:
Устройство Leica EM GP2 предназначено для всех лабораторий электронной микроскопии, в которых рассматриваются покрытые стекловидным льдом жидкие препараты или очень тонкие препараты посредством просвечивающей электронной криомикроскопии. Сюда входят биологические, вирусологические исследовательские лаборатории, лаборатории кристаллографии белков, фармацевтические, косметологические исследовательские лаборатории и промышленные лаборатории.
Виды препаратов, которые можно изготовить, чрезвычайно разнообразны. Это могут быть суспензии вирусов, липосом, микротрубочек, белков и других клеточных элементов, а также краски или растворы и эмульсии в водных и неорганических растворителях. Устройство Leica EM GP может использоваться для погружного замораживания не только препаратов на сетках для электронной микроскопии по технологии голой сетки, но также для сапфировых подложек и препаратов на планшетах криогенного скалывания.
Технология «голая сетка»
Многие препараты для просвечивающей электронной микроскопии могут готовиться способом погружного замораживания, при котором жидкий образец наносится пипеткой на сетку электронного микроскопа (обычно под покровным стеклом), а избыток перед погружением в криогенную среду, например, в жидкий этан, удаляется до образования тонкой пленки. Затем сетку можно непосредственно перенести в криогенных условиях в криоэлектронный микроскоп (просвечивающий) для исследования. Это и называется технологией «голой сетки».
Технологию «голой сетки» можно применять для различных препаратов – от внутриклеточных структур до промышленных эмульсий. Получение способом криоэлектронной макроскопии изображений макромолекулярных узлов, вирусов и клеток в их естественной, водной среде является самой современной технологией, обеспечивающей максимальное разрешение при минимальном повреждении препарата.
Несмотря на простоту способа, очень важным является возможность воспроизводимости толщины суспензии на сетке с образованием стекловидного льда, которая позволяет не затрачивать много времени на бесполезную загрузку препаратов в криоэлектронный микроскоп. Толщина пленки препарата составляет всего лишь сотни-десятки нанометров, из-за чего препарат в высокой степени подвержен влиянию перепада температуры и влажности перед заморозкой. Если влажность слишком низкая, пленка разрушается из-за быстрого высыхания. В случае если препарат подвергается воздействию отрицательных температур, его морфология может измениться до замораживания.
Компанией Leica Microsystems совместно с доктором Гюнтером Решем (Guenter Resch), представителем завода электронно-микроскопического оборудования IMP/IMBA (IMP/IMBA Electron Microscopy Facility) в Вене, Австрии была разработана плунжерная система криофиксации с целью стандартизации и придания технологии «голой сетки» повышенной воспроизводимости результатов.
Конструкция и функционирование устройства Leica EM GP
Плунжерная система криофиксации Leica EM GP2 позволяет замораживать препараты во вторичной криогенной жидкости, например, в этане, после удаления лишней жидкости путем промокания о фильтровальную бумагу в автоматическом режиме.
После присоединения зажима, удерживающего сетку на устройстве Leica EM GP2, контейнер со средой опускается и окружает сетку, обеспечивая создание защитной среды с управляемыми температурой и влажностью.
Порты доступа на обеих сторонах климатической камеры обеспечивают легкость введения растворов и взвесей пипеткой и с правой, и с левой сторон.
Затем избыточная жидкость удаляется путем автоматического одностороннего блоттинга с помощью фильтровальной бумаги. Система параллельного одностороннего блоттинга была разработана с целью предотвращения повреждения хрупких поддерживающих пленок. Блоттер касается за один раз сразу всей поверхности сетки. Можно запрограммировать автоматический поворот сетки на 180° перед блоттингом, чтобы обеспечить возможность удаления жидкости с нужной стороны.
Все параметры отображаются на сенсорной панели управления с возможностью просмотра и изменения цифровых настроек, например, времени впитывания, расположения сетки / блоттера, температуры, влажности, уровня жидкого азота и температуры вторичного хладагента.
После заморозки сетка переносится в предварительно охлажденную камеру для сетки внутри транспортного контейнера, заполненного жидким азотом, находящимся в сосуде Дьюара. После этого ее можно взять препаратным зажимом криоэлектронного микроскопа для подготовки к загрузке в микроскоп.
Система обзора
По выбору устройство Leica EM GP2 оснащается стереомикроскопом, который помогает выровнять и приготовить препарат. Светодиоды, установленные внутри климатической камеры и направляющие свет также вниз, на сосуд Дьюара, обеспечивают исключительно высокий уровень освещенности для наблюдения всего процесса подготовки и погружения препарата.
Сосуд Дьюара
После включения устройства Leica EM GP2 сосуд Дьюара объемом 1 литр можно наполнить жидким азотом перед сжижением вторичного хладагента, обычно этана. Полного сосуда Дьюара обычно хватает примерно на 1 час. Сжижение вторичного хладагента быстро, легко и безопасно выполняется с помощью разжижающей насадки. Насадка соединена с регулятором вторичного хладагента, расположенном на газовом баллоне, и газ медленно подается в насадку. Он конденсируется за секунды; емкость объемом 2,5 мл заполняется примерно за минуту. Крышка служит для предотвращения расплескивания жидкого азота и его попадания в этан при последующей заливке жидкого азота. Температура вторичного хладоагента может быть отрегулирована с панели управления. Емкость, заполненная жидким азотом, расположена в сосуде Дъюара и служит для удержания емкости сетки для передачи подготовленных, покрытых стекловидным льдом, препаратов.